microscope optique

1

Présentation

microscope optique, instrument utilisé pour obtenir une image agrandie d'objets, d'organismes vivants, ou de détails minuscules ou invisibles à l'œil nu.

2

Principe et caractéristiques d’un microscope optique

Le microscope optique (ou microscope photonique) est le descendant des premiers microscopes inventés en Hollande au XVII^e siècle. C’est le microscope le plus répandu. Il utilise les radiations électromagnétiques du spectre du visible (la lumière), du proche infrarouge ou de l’ultraviolet, dont la propagation est déviée et focalisée par des lentilles de verre. En permettant d’obtenir une image agrandie d’un objet, il a contribué à approfondir de façon considérable la connaissance du monde microscopique, de la physique à la chimie, de la pétrologie à la biologie.

Le microscope optique est constitué de différents éléments :

• une source de rayonnement lumineux et un dispositif d’éclairage de l’objet ;
• une optique constituée de plusieurs lentilles assurant la fonction d’agrandissement ;
• un détecteur permettant l’observation ou l’enregistrement de l’image (œil, émulsion photographique, caméra et moniteur TV) ;
• l’échantillon peut être observé en transmission s’il est partiellement transparent à la lumière, ou en réflexion s’il possède un fort pouvoir réfléchissant comme une surface métallique ou minérale.

Le microscope moderne est essentiellement constitué de deux systèmes de lentilles, l'objectif et l'oculaire, montés à chaque extrémité d'un tube fermé. L'objectif, constitué de plusieurs lentilles élémentaires, donne de l’objet une image réelle agrandie. Les lentilles du microscope sont conçues pour que l'image réelle formée par l'objectif se situe au foyer de l'oculaire ; l’oculaire, au travers duquel on observe à l’infini une image virtuelle agrandie, joue le rôle de loupe. L’objectif est en fait le cœur du microscope et de ses propriétés dépendent essentiellement les performances de l’appareil.

Pour un microscope à plein champ, où l’ensemble de la préparation est éclairé, on assimile l’objectif et l’oculaire à des lentilles simples. L’objet est représenté par un segment de longueur A₀B₀ dont l’objectif de distance focale f (de quelques millimètres) donne une image agrandie A₁B₁. De cette image située dans son plan focal objet, l’oculaire (distance focale f’ de quelques centimètres) donne une image A’B’ rejetée à l’infini et observée par l’œil. La mise au point s’effectue en modifiant la distance frontale entre l’objet et la face d’entrée de l’objectif.

Pour obtenir une photomicrographie, on introduit après l’oculaire un objectif photographique qui forme sur l’émulsion placée dans son plan focal une image réelle A’’B’’. Dans ce cas, on caractérise le fonctionnement du microscope par son grandissement linéaire total : g = A’’B’’/A’B’. Même si on augmente le grandissement au-delà de 1 000, la qualité de l’observation ne s’améliore pas car on atteint la limite de résolution de l’instrument. Le pouvoir de résolution, ou pouvoir séparateur, mesure la distance transversale minimale entre deux points dont les taches de diffraction peuvent être séparées ; il dépend de la longueur d’onde du rayonnement utilisé et de l’ouverture numérique de l’objectif.

Les lentilles de verre ne sont cependant pas exemptes de défauts. Elles souffrent en particulier de chromatisme, c’est-à-dire qu’elles focalisent mieux les radiations de plus courtes longueurs d’onde, ce qui entraîne des effets d’irisation lors de l’utilisation de la lumière blanche (mélange de toutes les radiations de longueur d’onde comprises entre 400 et 700 nm environ). De plus, même pour une lumière monochromatique, la focalisation n’est pas parfaite. Par exemple, les rayons marginaux convergent davantage que les rayons passant près de l’axe de la lentille, ce qui est responsable d’effets connus sous le nom d’aberration sphérique et de coma. Les lentilles de l’optique photonique présentent cependant une grande qualité, à savoir qu’elles peuvent être, soit convergentes, soit divergentes, selon la nature de la courbure de leurs faces. En associant plusieurs lentilles de propriétés différentes en doublets, triplets et multiplets, il est possible de réaliser des objectifs stigmatiques (donnant d’un objet une image unique et donc nette), pour lesquels le chromatisme, l’aberration sphérique et la coma sont corrigés.

Pour la recherche scientifique, compte tenu des dimensions des échantillons, on utilise des microscopes optiques plus perfectionnés. Ils permettent notamment de manipuler facilement les échantillons. Les platines des microscopes à haute résolution sont ainsi conçues pour être déplacées à l'aide de vis micrométriques ; dans certains microscopes, la platine peut également avoir un mouvement de rotation. De plus, tous les microscopes utilisés par les chercheurs sont équipés d'au moins trois objectifs, montés sur une tête pivotante, pour doter le microscope de plusieurs pouvoirs grossissants.

3

Microscopes optiques spécifiques

De nombreux types de microscopes ont été mis au point pour des applications spécifiques. Le microscope stéréoscopique est un microscope binoculaire à faible pouvoir de résolution, spécialement conçu pour converger automatiquement sur l'échantillon. Ces instruments fournissent des images tridimensionnelles.

Le microscope à ultraviolet utilise le rayonnement ultraviolet au lieu de la lumière visible. Les longueurs d'onde de ce rayonnement, plus courtes que celles de la lumière visible, procurent à ce type de microscope une meilleure résolution. L'absorption sélective de la bande des rayons ultraviolets dans différentes longueurs d'onde permet de renforcer certains détails de l'échantillon observé. Comme le verre ne laisse pas passer les ultraviolets de faible longueur d'onde, on utilise des systèmes optiques en quartz, en fluorine (ou fluorite) et des miroirs en aluminium. De plus, comme le rayonnement ultraviolet est invisible, on visualise les images par phosphorescence, par photographie ou par balayage électronique. On utilise le microscope à ultraviolet notamment en recherche médicale.

Le microscope polarisant permet de déterminer la nature et la quantité des constituants minéraux dans les roches ignées et les roches métamorphiques. Il est doté d'un prisme de Nicol ou d'autres dispositifs qui polarisent la lumière traversant l'échantillon à examiner. Un autre prisme de Nicol, ou analyseur, détermine la polarisation de la lumière après son passage à travers l'échantillon. Le microscope est également muni d'une platine pivotante qui permet de déterminer la modification de la polarisation provoquée par l'échantillon. L'utilisation de microscopes polarisants permet de visualiser, par le jeu de la direction de polarisation et de l'orientation des échantillons, des détails invisibles en lumière naturelle.

Le microscope à diffraction concentre un pinceau de lumière annulaire, cône de lumière extrêmement intense, sur l'échantillon. Le champ d'observation de l'objectif se trouve juste sous le cône. Ainsi, on observe uniquement la lumière diffractée par l'échantillon. Les parties éclairées de l'échantillon apparaissent comme un fond sombre et les minuscules éléments, objets de l'étude, sont violemment illuminés sur ce fond sombre. Cette forme d'éclairage est utile pour les matières biologiques transparentes et sans taches, ainsi que pour les objets minuscules qui ne peuvent être vus en éclairage naturel sous le microscope.

Dans le microscope à contraste de phase, on éclaire l'échantillon avec un pinceau lumineux conique creux, comme dans le microscope à diffraction. Cependant, dans le microscope à contraste de phase, le cône de lumière est plus étroit et entre dans le champ de vision de l'objectif. À l'intérieur de l'objectif, un dispositif en forme d'anneau réduit l'intensité de la lumière et introduit un décalage de phase. On obtient ainsi des images contrastées d'objets habituellement « en phase » avec la lumière naturelle (objets transparents, réfléchissants, etc.). Ce type de microscope est particulièrement efficace dans l'étude des tissus vivants ; il est, donc, largement utilisé en biologie et en médecine.

Parmi les microscopes optiques les plus avancés techniquement, on trouve le microscope confocal à balayage laser. Dans cet instrument, la source et le détecteur sont focalisés simultanément en un même point de l’échantillon par un jeu adapté de trous d’épingles (diaphragmes), de miroirs et d’objectifs communs. L’échantillon est éclairé et scruté point par point, grâce à un mécanisme de balayage optique du faisceau. Ce principe permet d’éliminer totalement la lumière qui ne provient pas du plan de mise au point optique. Par conséquent, on a ainsi accès à un contraste amélioré, une très faible profondeur de champ (de l’ordre de 0,5 µm) tout en conservant une résolution latérale de 0,2 à 0,3 µm par utilisation d’objectifs à immersion de forte ouverture numérique. Ce microscope confocal, permettant de réaliser des observations tridimensionnelles avec une résolution inférieure au micromètre dans les trois directions, représente le développement le plus important de la microscopie photonique au cours des dix dernières années, en particulier lorsqu’il est utilisé, avec des marqueurs spécifiques, pour l’observation des tissus et des cellules.